PRÁCTICA 9..ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS.


OBJETIVO
El objetivo de esta práctica es la separación de las distintas proteínas plasmáticas.

UTILIDAD CLÍNICA
Utiliza corrientes eléctricas
Este procedimiento nos permite detectar patologías.

FUNDAMENTO
Esta electroforesis sobre acetato de celulosa es de realización delicada, pues el colorante se fija químicamente sobre el soporte. Para evitar este inconveniente, se efectúa una hidrólisis en solución alcalina. El cellogel hidrolizado pierde su carácter lipofílico y se decolora perfectamente. Durante el desarrollo de la hidrólisis, las lipoproteínas no se alteran en absoluto.

MATERIAL
-Alimentador para electroforesis
-Cubeta de electroforesis
-Aplicador
-Tiras de acetato de celulosa
-Lámina Mylar
-Papel de filtro

APARATOS
-Electroforesis

REACTIVOS
-Solución tampón ( tris hiurato)
-Colorante rojo Ponceau
-Decolorante rojo ponceau (ácido citrico)
-Solución transparentadora
-Solución disolventes (ácido acético al 80%)

PROCEDIMIENTO
1.Preparación del buffer para técnicas semimicro: tome 100m de tris Hipurato concentrado para 1000 ml de agua destilada.


2.Preparación del decolorante: disolver el ácido citrico en 1000ml de agua destilada.El decolorante esta listo para usar cuando todo el material se ha disuelto y se ha mezclado completamente.
3.Equilibrado de las tiras : introducir una o mas tiras en 100ml de buffer.
4.Preparación de la cámara de electroforesis: llenar completamente el compartimento de la cámara de electroforesis. Inclinar la cámara para igualar el nivel de ambos compartimentos.
5.Selección de la muestra: utilizar suero muy fresco .Evitar utilizar plasma por que el fibrinogeno puede crear errores.
6.Secado de las tiras: Colocar las tiras entre dos hojas de papel.
7.Colocación de las tiras en el puente y aplicador de suero: colocar las tiras con la cara absorbente hacia arriba .Colocar el puente en la cámara de electroforesis ,aplicar la muestra en las tira.
8..Tiempo y voltaje: conectar la fuente a de alimentación a 200V , durante 35 minutos.Desconectar la fuente de alimentación y sacar las tiras.
9.Tinción detira:sumergir las tiras en colorante Ponceau durante 5 minutos.
10.Decoloración de la tira: sumerjir las tiras en una solución de ácido citrico. Aplicar 3-4 baños hasta obtener un fondo blanco.

          

11.Transparentado: sumergir las tiras en solución de transparentado, durante 1 minuto. Colocar las tiras sobre una superficie de Myller film, cortar los bordes y
eliminar el exceso de liquido con una pipeta. Calentar la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos.Esperar a que la tira alcance la temperatura ambiente una vez sacada de la estufa,.Ya se puede proceder a su lectura.
 
12.Cuantificación por fotodensitómetro: Introducir la tira, ajustar el fotodensitómetro en color rojo , presionar el botón de iniciar el proceso para el trazado del proteinograma.

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