PRÁCTICA 22. ESTUDIO DE HECES.

PRÁCTICA 3.DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA POR EL MÉTODO DE LA HEXOKINASA.

                                    FECHA: 05/10/2017
OBJETIVO
El objetivo de ésta práctica es la medición de la glucosa en suero o plasma por método cuantitativo.

UTILIDAD CLÍNICA

Medida de concentración de glucosa libre en la sangre, suero o plasma sanguíneo. Durante el ayuno, los niveles normales de glucosa oscilan entre 70 y 100 mg/dL.

Cuando la glucemia es inferior a este umbral se habla de hipoglucemia; cuando se encuentra entre los 100 y 125 mg/dL se habla de glucosa alterada en ayuno, y cuando

supera los 126 mg/dL se alcanza la condición de hiperglucemia.

FUNDAMENTO
La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo. Las insulinas facilitan la entrada de glucosa en las células.
La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con una hiperglucemia, causada por el déficit de insulina.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de
laboratorio.
La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. La
glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH.
Glucosa + ATP -----(HK)------Glucosa-6-fosfato + ADP
G6F + NAD+ ---- (G6F-DH)---  6-Fosfogluconato + NADH + H+
El aumento de la concentración de NADH en el medio es a la concentración de glucosa
presente en la muestra ensayada.

APARATOS
-Espectrofotómetro

MATERIAL
-Cubo de sucio -Suero    -Orina
-Pipetas manuales y automáticas     -Gradillas  -Auxiliar de pipeteo
-Cubetas de 1,0cm de paso de luz   

REACTIVOS
R1 Tampón ( tris pH 7,5 , ATP, Mg)
R2 Enzimas ( NAD, Hexoquinasa, Glucosa-5-fosfato
Glucosa CAL

PROCEDIMIENTO
1.Añadimos unas gotas de R1 al bote de R2 agitamos durante unos minutos y lo echamos todo en el bote de R1.

2.Rotulamos los tubos de ensayo.

3.En  cada tubo añadimos un 1ml/1000yl con una pipeta automática de RT.
4.Metemos en el baño a incubar unos 5 minutos a 37ºC.
5.En el tubo rotulado con patrón, añadimos 10yl de este.
6.En el tubo rotulado con muestra, añadimos 10yl  de esta.

7.Los volvemos a introducir en el baño para incubar 5 minutos a 37ºC.

8. Medimos en el espectrofotómetro, previamente se ha encendido. Ajustamos el espectro con la longitud de onda que nos dan en este caso 340nm.

!OJO! La cubeta de espectrofotometría se debe coger por la parte de arriba o la rallada si no fuera el caso limpiar sus paredes lisas, si se derrama algún líquido ,

por sus paredes también hay que limpiarlo, porque no da buenas lecturas. La reacción es estable 30 minutos.

-Lo primero que haremos será poner el espectro a “0”, esto se hace midiendo una de las cubetas con agua destilada, meteremos la cubeta en su lugar, cerramos la tapa, presionaremos el botón donde aparezca

“ Medir blanco”, una vez se encuentre en 0,000 podremos medir las muestras y tubo problema.
-Para medir las muestras y el tubo PB; vaciamos la solución en la cubeta de espectrofotometría, colocamos en el aparato cerramos la  tapa y lo mide automáticamente, hacer igual para medir el tubo PB.

RESULTADOS
-Muestra: 0,341           
-TPB: 0,402