PRÁCTICA 7.DETERMINACIÓN DE Hb A1c POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.

                                FECHA:24/10/2017
OBJETIVO

Determinar el Hb A1c de una muestra.
Cuantificar las fracciones de hemoglobina y la hemoglobina total.
UTILIDAD CLÍNICA
La determinación se realiza por intercambio iónico.

FUNDAMENTO
Después de preparar un hemolizado, donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico, La hemoglobina A1c (HbA1C)
se eluye de forma específica, previa eliminación por lavado de la hemoglobina A1A + B (HbA1A+B), y se cuantifica por lectura fotométrica.
APARATOS
Fotómetro

MATERIAL
-Sangre total con heparina       -Micro-columnas     -Puntas de pipetas
-Pipetas automáticas    -Cementerio      -tubos eppendorf

REACTIVOS
R1: 30ml. Biftalato potásico, detergente ph5.
R2: 50ml.Tampón fosfatos ph6,5 , azida sódica
R3: 450ml. Tampón fosfatos ph6,4 , azida sódica.



PROCEDIMIENTO
1.Atemperar reactivos unos minutos e invertir la columna unos 10/15 minutos para des compactar las bolitas.
   

2.Pipetear en tubo de ensayo 50 yl de sangre y 200yl de reactivo 1, homogeneizar el hemolizante y dejar 10-15 minutos.

   

3.Quitar el tapón a la columna, romper la espita y bajamos el disco hasta la columna.
4.Preparamos los reactivos a utilizar en tubos eppendorf.
5.Dejar caer el líquido de la columna, añadimos 50yl de hemolizante con una pipeta automática.
6.Cuando el disco absorba el hemolizante y se ponga de color mate se añade 200yl de R2.

   

7.Cuando baje completamente añadimos con una pipeta pasteur 2ml de R2, una vez ya no quede mas de esta solución cambiamos el tubo done se deposita esta disolución.
8.Añadimos 4ml de R3 ( diferente ph) y este se recogerá la hemoglobina glucosada.
9.En un tubo de los grandes ponemos 12ml de reactivo R3 y 50 yl de hemolizado.

10.Medimos esta última solución, el blanco y el hemolizante, en el espectrofotómetro, ajustamos a 415mn.


RESULTADOS
-Patrón: 1,101
-Muestra: 0,124   
0,124/3x1,101x100= 3,7% HbA1c


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