PRACTICA 13. INMUNODIFUSIÓN RADIAL.


PRÁCTICA13. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍ AS POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL (MANCINI).

 FECHA:28/11/2017

 OBJETIVO
Comprobar la existencia de IgG en una muestra de suero y determinar su concentración, en caso de que exista.
UTILIDAD CLIICA
FUNDAMENTO

 La inmunodifusión radial es una técnica que nos permite la identificación y cuantificación de un antígeno concreto ( una proteína).
 MATERIALES 
-Placas de Petri de 55mm
-Pipetas automáticas
-Puntas de pipetas
-Patrones de IgG ( 0'05, 0'1, 0'2, 0'4 mg/mL) o albumina al 22%
-Anticuerpo anti-IgG
-Muestra de suero con concentración de IgG
-Agua destilada
-Agarosa
-Tampón de inmunodifusión
-Cámara humedad

PROCEDIMIENTO
1.Preparación del gel de agarosa.
 Pesamos en la balanza 1,5g de agarosa
 En una probeta medimos 100ml de tampón
  
 Añadimos a un matraz aforado el gel de agarosa y los 100ml de tampón, removemos.
 Calentamos en el microondas hasta que la solución este transparente, remover.
 Llevar al baño que previamente a sido encendido a 40ºC .

2.Recortar la punta de una pipeta pasteur para realizar los pocillos en el gel.
3.Cuando el gel de agarosa llegue a 40ºC le añadimos 1ml de anti IgG  y homogeneizar.
4.Metemos la pipetas gradual manual en el baño, para cuando añadamos el gel de agarosa a las placas no se salifiquen.
5.Añadir a cada placa de 8ml a 9ml.
6.Dejar solificar y hacer los pocillos con la pipeta pasteur en vertical.




7.Dispensamos los patrones 10yl en los pocillos de fuera procurando mantener el orden e menor a mayor concentración y la muestra 10yl en el pocillo del centro.
8.Colocamos la placa destapada  en una placa de Petri con dos o tres papeles de filtro humedecidos con agua destilada y tapamos durante mas o menos 24h. Para que se realice la difusión de Ag y Ac.



Si los resultados son claramente visibles en este caso si lo son, pasamos a la lectura y cuantificación de los halos.
Medir el diámetro de los anillos de precipitación y realizar una curva de calibración enfrentando el cuadrado de los diámetros de los patrones con su concentración.
En el caso de que los halos no se han visibles se realizaría una tinción de colorante Negro Amido.

RESULTADOS:

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