PRÁCTICA 14. INMUNODOTTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES ( Auto-AC contra M2 nPDC, M2 recombinante).
FECHA:14/12/2017
FUNDAMENTOS Y UTILIDAD CLÍNICA:
La prueba se basa en el principio del Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto - Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G / Ig M humanas. El conjugado se une a los complejos Ag - Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.
APARATAJE:
Agitador
MATERIALES:
Tiras dot
Bandejas de incubación
Pipetas automáticas
Puntas de pipeta
Vaso de precipitado
REACTIVOS:
Tampón de lavado concentrado ( tampón incoloro).
Tampón de dilución ( tapón amarillo)
Conjugado ( tapón rojo)
Sustrato ( bote marrón)
PROCEDIMIENTO:
Realizamos una dilución 1/10 del tampón de lavado concentrado.
1. Colocar una tira por muestra en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.
2. Añadimos 2 mL de tampón de lavado. Incubamos durante 10 minutos en agitación.
Si la incubación es correcta, los puntos azules de la tira desaparecen, sino es así seguir incubando.
3. Eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. o con pipetas automáticas.
4. Añadimos 1'5 mL de tampón de dilución.
5. Añadimos 10 micro litros de la muestra e incubamos durante 30 minutos en agitación. Evitar que la punta de las pipetas no toque la membrana.
6. Eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
7. Lavar tres veces ( durante 3 minutos cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Después de cada lavado eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
8. Añadimos 1'5 mL de conjugado e incubamos durante 30 minutos por agitación.
9.Eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
10.Lavar tres veces ( durante 3 minutos cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Después de cada lavado eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
11.Añadimos 1'5 mL de sustrato e incubamos durante 10 minutos en agitación.
12.Eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
13.Lavar con 1.5 ml de tampón de lavado. Después de cada lavado eliminar el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
14.Extraer las tiras de los canales y dejarlas secar en papel absorbente.
Nuestra tira es la numero 13.
RESULTADOS:
Resultado es negativo : cuando un anticuerpo especifico si la intensidad e color del punto corresponde a su Ag es menor o igual que la intensidad de color del control negativo.
Comentarios
Publicar un comentario